Perché è necessario eseguire il rilevamento in vivo di virus esogeni?
Nel sistema di valutazione della sicurezza virale per i prodotti biologici, l'inoculazione negli animali in vivo è un metodo di rilevamento non-specifico maturo e consolidato da tempo. Implica l'inoculazione del campione da testare in animali da laboratorio sensibili o embrioni di pollo, utilizzando il sistema vitale intatto e la risposta immunitaria dell'animale per rivelare una potenziale contaminazione virale infettiva. Sebbene il sequenziamento di nuova generazione (NGS) e altri metodi molecolari siano stati accettati da alcune normative come alternative moderne con progressi tecnologici, il classico metodo in vivo, grazie ai suoi principi di rilevamento biologico unici, detiene ancora una posizione importante nelle farmacopee di molti paesi in tutto il mondo e rimane uno dei metodi fondamentali per la valutazione della sicurezza virale.
Tecnologia principale: metodo di inoculazione in vivo per animali ed embrioni di pollo
L'inoculazione in vivo negli animali e negli embrioni di pollo è una tecnica di rilevamento in vivo che utilizza un sistema ospite vivo per lo screening virale ad ampio-spettro. Il suo principio fondamentale è il seguente: il campione da testare viene inoculato in un ospite animale suscettibile (cucciolo, ratto adulto, porcellino d'India, coniglio o embrione di pollo) attraverso molteplici vie (intracerebrale, peritoneale, sacco vitellino, cavità allantoidea, ecc.). Se nel campione è presente un virus infettivo, può replicarsi all'interno dell'ospite e produrre effetti patogeni diretti (sintomi clinici caratteristici, danno istopatologico o morte). Monitorando e registrando attentamente i tassi di sopravvivenza degli animali, è possibile dimostrare indirettamente la presenza di virus vivi infettivi nel campione. Questo metodo è in grado di rilevare virus che sono difficili da proliferare in colture cellulari in vitro o che non producono lesioni tipiche (come alcuni enterovirus e arbovirus), fungendo così da fondamentale supplemento normativo ai sistemi di screening virale in vitro.
Nell’attuale sistema normativo globale per i prodotti biologici, la logica applicativa dell’inoculazione in vivo ha subito profondi cambiamenti e i suoi requisiti fondamentali possono essere riassunti come segue:
La pubblicazione della Farmacopea cinese (edizione 2025) segna un cambiamento fondamentale: il metodo di inoculazione sugli animali è passato da "test obbligatorio" a "strategia basata sul rischio-". Le normative sottolineano la necessità di una valutazione del rischio insieme a considerazioni relative alle cellule e ai processi e aprono percorsi alternativi come metodi convalidati come NGS. Impongono inoltre requisiti più severi sui parametri chiave (come il periodo di osservazione di 28 giorni) per ottenere un controllo preciso ed efficiente della sicurezza dei virus.
Una volta determinato il metodo, è necessario prestare particolare attenzione alle differenze nei dettagli operativi tra i diversi sistemi normativi. Le principali farmacopee globali (come ChP, USP, EP) dispongono di normative specifiche riguardanti parametri tecnici chiave quali età, peso, numero degli animali, via di somministrazione e periodo di osservazione. La progettazione del protocollo deve rispettare rigorosamente le ultime normative applicabili al mercato di riferimento per ottenere un preciso adattamento alla conformità.
Informazioni di riferimento: i lignaggi virali target elencati sono estratti dalla Tabella 5 (test di screening del virus in vivo) delle Regole generali USP-NF<1237>"Metodi di rilevamento dei virus".
Tecnologie principali: test di produzione di anticorpi (MAP, RAP e HAP)
I test di produzione di anticorpi (MAP/RAP/HAP) sono metodi di screening specifici in vivo per gruppi viroginseng noti di una specie specifica. Il principio fondamentale è il seguente: il campione da testare viene inoculato in un animale ospite suscettibile che è privo di agenti patogeni specifici (SPF). Se il campione contiene virus attivi o antigeni virali, nell'ospite verrà suscitata una risposta immunitaria umorale specifica. Dopo un periodo di osservazione prescritto (di solito 28 giorni o più), viene rilevata la presenza di anticorpi specifici contro il virus bersaglio nel siero dell'animale. La rilevazione degli anticorpi sierici è la prova diretta della presenza di virus infettivi o componenti virali immunogenici nel campione.
Riferimento: I lignaggi virali elencati nella tabella seguente derivano dalla linea guida ICH Q5A(R2) (Tabella 3) e coprono i principali virus bersaglio che la linea guida richiede di screening
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