Considerazioni chiave sulla progettazione per i protocolli di studio di convalida della clearance virale dei prodotti di terapia genica

ICH Q5A(R2)-Fondazione internazionale per l'armonizzazione

ICH Q5A(R2) è stato adottato ufficialmente il 1° novembre 2023 e rappresenta il documento guida internazionale fondamentale per la valutazione della sicurezza virale. Rispetto al Q5A(R1) pubblicato nel 1999, gli aggiornamenti significativi nella versione R2 includono: un capitolo appena aggiunto sulla valutazione della sicurezza virale nella produzione continua (Capitolo 7); un ruolo rafforzato della valutazione del rischio come fondamento delle strategie di eliminazione virale; incorporazione del sequenziamento di prossima generazione (NGS) nelle considerazioni sul rilevamento virale; e requisiti espliciti per la valutazione di nuovi prodotti e processi di produzione. Q5A(R2) è stato adottato dalle autorità di regolamentazione tra cui FDA, EMA e PMDA, fornendo un quadro tecnico unificato per la convalida dell'eliminazione virale in tutto il mondo.

NMPA-Sistema normativo cinese

Il quadro normativo NMPA per la sicurezza virale copre più livelli:

Livello documento	Nome del documento	Anno di emissione
Documento fondativo	Linee guida tecniche per la rimozione/inattivazione dei virus dagli emoderivati	2002
Documento fondativo	Principi generali per la revisione tecnica della valutazione della sicurezza virale dei prodotti derivati ​​dai tessuti biologici-e dai prodotti espressi dalle cellule eucariotiche-	2005
Linee guida specifiche del prodotto-	Linee guida tecniche per la ricerca farmaceutica e la valutazione delle domande di sperimentazione clinica per prodotti di terapia genica in vivo basati su Adeno-Virus associato (rAAV) vettoriale-	2023
Linee guida specifiche del prodotto-	Requisiti tecnici comuni per la qualità farmaceutica dei prodotti di terapia genica in vivo basati su Adeno-Virus associato (rAAV) vettoriale-ricombinante per le domande di autorizzazione all'immissione in commercio	2025
Linee guida innovative	Linee guida tecniche per la convalida della piattaforma dei processi di eliminazione virale per le applicazioni di sperimentazione clinica di prodotti terapeutici a base di proteine ​​ricombinanti (prova)a	2024

R: Questa linea guida rappresenta la prima volta che l'autorità di regolamentazione cinese stabilisce requisiti tecnici sistematici per la convalida della piattaforma dei processi di eliminazione virale ed è in linea con lo spirito dell'ICH Q5A(R2).

FDA ed EMA-Requisiti normativi statunitensi ed europei

Nel gennaio 2024 la FDA ha formalmente pubblicato un documento guida di settore basato sull'ICH Q5A(R2). Inoltre, il capitolo della Farmacopea degli Stati Uniti (USP)<1050.1>fornisce una guida tecnica supplementare sulla progettazione, valutazione e caratterizzazione delle procedure di eliminazione virale. La FDA organizza ogni due anni un simposio sull'eliminazione virale; il simposio del 2023 ha affrontato-argomenti all'avanguardia come nuove modalità, produzione continua, nuovi mezzi cromatografici e filtri adsorbenti. I documenti guida principali dell'EMA includono CPMP/BWP/268/95 (Nota per la guida sugli studi di validazione dei virus: progettazione, contributo e interpretazione degli studi che convalidano l'inattivazione e la rimozione dei virus) ed EMEA/CHMP/BWP/398498/2005 (Linee guida sulla valutazione della sicurezza dei virus dei prodotti medicinali sperimentali biotecnologici), entrambi armonizzati con l'ICH Q5A(R2).

Identificazione delle fonti di contaminazione virale

ICH Q5A(R2) sottolinea che la progettazione della validazione della clearance virale dovrebbe basarsi su una valutazione completa del rischio. Per i prodotti di terapia genica, l’identificazione delle fonti di contaminazione virale dovrebbe riguardare i seguenti livelli:

Livello banca cellulare: virus endogeni (ad esempio particelle retrovirali) e virus infettivi latenti potenzialmente ospitati nei substrati cellulari di produzione (ad esempio HEK293, CHO, HeLa). È noto che le cellule HEK293 contengono sequenze endogene Ad5 E1 e un frammento EBV di circa 900 bp e sono in grado di esprimere adenovirus competente per la replicazione; pertanto, particolare attenzione dovrebbe essere prestata a questo rischio nella valutazione del rischio.

Livello del virus helper: la produzione del vettore AAV utilizza in genere metodi come la tripla trasfezione utilizzando plasmidi helper, che comportano il rischio di generare adenovirus competente per la replicazione (RCA). Allo stesso modo, le cellule di confezionamento utilizzate nella produzione di vettori lentivirali possono generare lentivirus competenti di replicazione (RCL).

Livello delle materie prime: i virus avventizi possono essere introdotti attraverso le materie prime utilizzate nella produzione, inclusi terreni di coltura cellulare, mangimi ed enzimi. Questo rischio è particolarmente significativo quando vengono utilizzati componenti di derivazione animale- (ad esempio, siero fetale bovino, soluzioni di digestione della tripsina).

Differenze di rischio: terapia genica rispetto alle proteine ​​ricombinanti tradizionali

Dimensione del rischio	Prodotti proteici ricombinanti tradizionali	Prodotti per la terapia genica
Fonte virale	Virus endogeni da banca cellulare; virus avventizi	Virus delle banche cellulari; virus ausiliari; vettori competenti di replicazione-(RCV/RCL); integrazione del genoma dell'ospite
Substrato cellulare	CHO, NS0, Sp2/0 e altre linee cellulari ben-caratterizzate	HEK293, HeLa, CHO, ecc.; alcune linee cellulari sono di origine tumorigenica
Caratteristiche del prodotto	Farmaco a base di proteine-; struttura ben-definita	Vettore virale; comporta rischi per la biosicurezza
Strategia di validazione	Eliminazione virale in più-fasi; enfasi sulla convalida delle fasi del processo	È richiesto il rilevamento RCV/RCL; sia la convalida che il test sono essenziali
Convalida della piattaforma	Applicabile a processi consolidati come S/D, basso pH, nanofiltrazione	Applicabilità limitata a causa della diversità dei tipi di vettori

Tabella 1. Confronto dei rischi per la sicurezza virale: prodotti di terapia genica rispetto a prodotti proteici ricombinanti tradizionali

Principi generali

La selezione del virus indicatore è un elemento centrale nella progettazione dei protocolli di convalida della clearance virale. ICH Q5A(R2) richiede che la selezione del virus indicatore sia basata sulla valutazione del rischio e tenga conto dei seguenti fattori:

Rilevanza del virus rispetto al substrato della cellula di produzione (virus rilevante)

Proprietà fisico-chimiche del virus (avvolto/non-avvolto, DNA/RNA, intervallo di dimensioni)

Resistenza del virus ai trattamenti fisico/chimici

Rilevabilità e biosicurezza del virus

Per i prodotti di terapia genica, la selezione del virus indicatore deve inoltre considerare: il ruolo del virus vettore stesso come “virus rilevante”; il potenziale rischio di contaminazione da virus helper; e i requisiti di rilevamento e convalida dei virus competenti per la replicazione (RCV/RCL).

Pannello indicatore virus consigliato

Virus	Tipo	Busta	Genoma	Dimensioni (nm)	Motivazione/Applicazione della selezione
MVM	Parvovirus	Nessuno	ssDNA	18–26	Modello non-avvolto; dimensioni più piccole e massima resistenza; adatto per la validazione della nanofiltrazione (generalmente non applicabile ai prodotti vettoriali rAAV)
PPV	Parvovirus	Nessuno	ssDNA	18–26	Modello non-avvolto; virus indicatore comunemente utilizzato per i prodotti sanguigni
Reo-3	Reovirus	Nessuno	dsRNA	60–80	Modello non-avvolto; taglia media; elevata stabilità fisica
PRV	Herpesviridae	SÌ	dsDNA	150–200	Modello avvolto; grandi dimensioni; ampia gamma di ospiti
X-MuLV	Retrovirus	SÌ	ssRNA	80–110	Modello di retrovirus con involucro; appropriato per substrati cellulari derivati ​​da CHO-
BVDV	Flaviviridae	SÌ	ssRNA	40–60	Modello avvolto; utilizzato per valutare metodi di inattivazione chimica (surrogato dell'HCV)
VSV	Rhabdoviridae	SÌ	ssRNA	70	Modello avvolto; ampia tolleranza al pH; adatto per la convalida dell'inattivazione a basso-pH

Tabella 2. Pannello dei virus indicatori raccomandati per la convalida della clearance virale dei prodotti di terapia genica

Considerazioni speciali per i prodotti AAV Vector

Per i prodotti vettoriali AAV ricombinanti, le Linee guida tecniche NMPA per la ricerca farmaceutica e la valutazione delle applicazioni di sperimentazione clinica per i prodotti di terapia genica in vivo basati su vettori rAAV-richiedono attenzione al rilevamento dell'AAV competente per la replicazione-(rcAAV). rcAAV si riferisce ad AAV capace di replicazione autonoma, che tipicamente deriva dalla ricombinazione omologa tra il plasmide helper e il genoma AAV del prodotto. Il rilevamento di rcAAV viene generalmente eseguito utilizzando test infettivi o metodi qPCR, condotti separatamente sulla sostanza farmaceutica e sul prodotto purificato.

Vale la pena notare che i processi di purificazione a valle per i prodotti vettoriali AAV includono tipicamente la digestione con nucleasi, la cromatografia (AEX), la nanofiltrazione e la cromatografia a scambio ionico (CEX/IEX). Nella tradizionale validazione della clearance virale, queste fasi del processo possono comportare perdite significative del vettore AAV stesso; pertanto, l'interazione tra il vettore e i virus indicatori deve essere attentamente considerata durante la progettazione del modello ridimensionato. Per alcune fasi del processo (ad esempio, nanofiltrazione) in cui le perdite del vettore AAV sono sostanziali, dovrebbe essere valutato se sono giustificati aggiustamenti del processo sulla base dei dati di validazione (ad esempio, regolazione della dimensione dei pori della membrana di nanofiltrazione).

Principi generali

Il modello scale-down (SDM) è lo strumento principale per la convalida dell'eliminazione virale; la sua progettazione deve rappresentare accuratamente le prestazioni di eliminazione virale del processo di produzione. ICH Q5A(R2), Sezione 6.2.2, richiede esplicitamente che il modello di riduzione-mantieni la coerenza con il processo di produzione nei parametri chiave. Per i prodotti di terapia genica, le seguenti considerazioni sono particolarmente importanti nella progettazione dell’SDM:

Rappresentatività dei parametri critici del processo

Il modello di riduzione- deve essere coerente con il processo di produzione nei seguenti parametri: condizioni cromatografiche (composizione del tampone, pH, conduttività); rapporto di carico (rapporto di massa proteica vettore/supernatante); tempo e temperatura di contatto; portata/tempo di permanenza; purezza e composizione del prodotto. Per i prodotti AAV, dovrebbe essere affrontato in modo specifico anche l'effetto della distribuzione delle dimensioni delle particelle vettoriali e del contenuto di capside vuoto sulle prestazioni di nanofiltrazione.

Requisiti di qualificazione del modello

L'ICH Q5A(R2) richiede un'adeguata qualificazione del modello di riduzione-, tra cui: confronto degli attributi di qualità del prodotto (ad es. purezza, recupero, densità); qualificazione della coerenza dei parametri critici del processo; e garantire che il modello di riduzione- catturi la variabilità del processo di produzione. Per le fasi cromatografiche, è necessario valutare la consistenza del profilo dei picchi, dell'eluizione e del lavaggio; per le fasi di nanofiltrazione, è necessario verificare gli effetti della capacità volumetrica e della composizione del prodotto.

Formula di calcolo dell'LRV

Il valore di riduzione logaritmica (LRV) è la metrica fondamentale per misurare l’efficacia della clearance virale. ICH Q5A(R2), Sezione 6.5, fornisce una descrizione dettagliata dei metodi di calcolo dell'LRV e del trattamento statistico. La formula di base per il calcolo dell'LRV è: LRV=log₁₀(N₀/N), dove N₀ è il titolo virale iniziale dopo l'aggiunta del virus e N è il titolo virale residuo dopo il trattamento del processo. Quando il titolo virale residuo scende al di sotto del limite di rilevamento del test, dovrebbero essere utilizzati metodi di stima come la distribuzione di Poisson (ad esempio, test su grandi-volumi).

Applicazione degli intervalli di confidenza

Sia ICH Q5A(R2) che EMA CPMP/BWP/268/95 richiedono la valutazione dell'intervallo di confidenza dei risultati del calcolo dell'LRV. In genere viene applicato un intervallo di confidenza del 95%.

Criteri di efficacia

Secondo le Linee guida tecniche NMPA per la rimozione/inattivazione dei virus dagli emoderivati, una riduzione del virus maggiore o uguale a 4 log indica che la fase del processo è efficace per la rimozione/inattivazione del virus. Tuttavia, questo criterio non è una soglia assoluta e dovrebbe essere valutato in modo olistico insieme alle curve cinetiche di inattivazione, al razionale scientifico per la selezione del virus indicatore e alla solidità complessiva della progettazione del protocollo di validazione. Per i prodotti di terapia genica, occorre prestare particolare attenzione alla capacità di eliminazione cumulativa in tutte le fasi del processo per garantire che il profilo complessivo di sicurezza virale sia a un livello accettabile.

Applicazione e sfide della nanofiltrazione

La filtrazione-ritentiva dei virus (nanofiltrazione) è una fase fondamentale di eliminazione virale nella purificazione a valle dei prodotti di terapia genica. I tipici filtri che trattengono i virus-hanno una dimensione dei pori di circa 20 nm. Il meccanismo di eliminazione virale della nanofiltrazione è principalmente un'esclusione basata sulla dimensione- e può rimuovere efficacemente la maggior parte dei virus più grandi della dimensione dei pori della membrana, compresi i piccoli parvovirus senza-enveloper come MVM e PPV.

Tuttavia, la nanofiltrazione per i prodotti di terapia genica deve affrontare sfide uniche: la dimensione dei vettori AAV (circa 20–26 nm) è simile a quella di alcuni virus indicatori (ad esempio, MVM, 18–26 nm), il che può comportare un ridotto recupero del vettore; i capsidi vuoti possono influenzare il flusso di filtrazione e l’efficienza della ritenzione virale; la viscosità del campione può aumentare significativamente con la concentrazione del vettore. Pertanto, la progettazione SDM per la validazione della nanofiltrazione dovrebbe tenere pienamente conto degli effetti della distribuzione delle dimensioni delle particelle del vettore e del contenuto del capside vuoto sulle prestazioni di filtrazione e si dovrebbe prendere in considerazione l'utilizzo di membrane di nanofiltrazione con dimensioni dei pori più grandi, a seconda dei casi.

Valutazione della clearance virale delle fasi cromatografiche

La cromatografia a scambio ionico (IEX) è una fase fondamentale nei processi di purificazione dei prodotti AAV, in genere impiega la digestione delle nucleasi seguita dalla cromatografia a scambio anionico (AEX) per catturare capsidi vuoti e difettosi, o la cromatografia a scambio cationico (CEX) per la purificazione fine dei capsidi completi. I meccanismi di eliminazione virale nelle fasi cromatografiche includono l'esclusione dimensionale, le interazioni elettrostatiche, le interazioni di affinità e altri fattori. Le discussioni al Viral Clearance Symposium della FDA del 2023 hanno evidenziato che l'efficacia della clearance virale delle fasi cromatografiche è influenzata da molteplici fattori, tra cui capacità di carico, pH, conduttività e ciclo della resina; per una valutazione completa dovrebbe essere adottato un approccio di progettazione ortogonale multi-fattore.

Controllo della sicurezza virale nella produzione continua

Il nuovo capitolo 7 dell'ICH Q5A(R2) stabilisce requisiti specifici per la valutazione della sicurezza virale nella produzione continua. Per i prodotti di terapia genica, la produzione continua è diventata un’importante direzione di sviluppo, ma introduce anche nuove sfide per la sicurezza virale. Le strategie di controllo della sicurezza virale nella produzione continua includono:-filtri barriera antivirus in linea come misure di contenimento critiche; progettazione adeguata dei tempi di permanenza e dei flussi di processo; incorporazione di fasi di inattivazione con tempi di attesa definiti; e una migliore applicazione della tecnologia analitica di processo (PAT) per il monitoraggio in tempo reale-dei parametri critici del processo.